肺移植医療において最も深刻な問題の1つは、肺移植後の生存率である。国際心肺移植学会のレジストリレポートによれば、肺移植後の5年生存率は55%であり、他の臓器移植に比較し、予後は不良である。肺移植後慢性期(1年目以降)の死因のトップは、慢性拒絶反応であり(国際心肺移植学会レジストリレポート、図2)、近年は慢性移植肺機能不全(Chronic lung allograft dysfunction: CLAD)と呼ばれる。慢性的な拒絶反応がその病態に関与するとされているが、不明な点が多く、現在も有効な治療法は確立していない。年間多くの肺移植レシピエントがCLADにより死亡したり、再移植を要したりしている。 本研究は、間葉系幹細胞(Mesenchymal stromal cells; MSC)が有する抗炎症作用や免疫抑制作用に着目した研究である。さらに、我々はMSCから放出され、mRNAやmiRNAやタンパク質などを運び、細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たすとされている細胞外小胞(Extracellular vesicles; EVs)に着目し、MSCと同様な抗炎症作用や免疫抑制作用を有するか検討することを目的とした。2021年度（R3年度）は、MSC由来のEVsの解析方法の確立とMSCの培養方法の検討すること、さらに動物モデルを使用したパイロットスタディーを行うことを予定していた。

本研究の主たる目的は肺移植術後の慢性期の主たる死因であり、通常の免疫抑制療法では制御困難な慢性移植機能不全 (Chronic Lung Allograft dysfunction, CLAD)のメカニズムを解明することにある。本研究では自然免疫刺激が同種抗原反応を増強することと肺という外界に開かれた臓器の特性に着目し、移植術時の虚血再灌流障害と移植後の慢性気道炎症という2つの臨床肺移植に則したシナリオをマウス肺移植に適用したCLADモデルを確立・報告した。これらのモデルは同種抗原と自然免疫刺激の両者に依存的な肺線 維化を認める。線維化病巣が空間的に異なる２つのCLADの2つのサブタイプに特徴的な組織像を再現する実験モデルであり、それぞれの特徴的な変化および共通のパスウエイを解析できる。 本年度は本邦でのマウスCLADモデル立ち上げのための研究をおこなった。本研究で用いるC57BL/10マウスはブリーダーごとに背景がやや異なることが経験的にも学術論文からもわかっている。そこで本年度はTLR4のフェノタイプの異なるC57BL/10マウスを用いた肺移植を行い、肺移植後の表現型について検討を行った。さらに、系統の異なるマウス同士を掛け合わせて仔マウス(F1マウス)を用いた肺移植を行い、肺の線維化病変について検討を行った。 本年度の結果から今後の研究を行うにあたり適切なマウスの組み合わせ、移植前後での自然刺激に必要性について確認ができたため、次年度は追加の肺移植および、データ解析を行う。

ドナー肺葉ごとの移植適応評価を確立するために大動物モデルを用いて研究を行った． ①ブタ肺葉移植モデルの確立：ドナーとして体重45 kgのヨークシャー種家畜ブタを用いた．全身麻酔下に肺動脈本幹より灌流用カニューレを挿入し，4℃に冷却した肺保存液にて両肺を灌流，冷却し，両肺および心臓を一塊に摘出した． 6時間の冷虚肺保存ののち，左肺を上葉と下葉に分け，気管支，肺動脈，肺静脈をトリミングした．レシピエントとしてドナーより大型の体重30kgのブタを用いた．全身麻酔下に左主肺動脈，左上下肺静脈，左主気管支を各々クランプし切離，左肺上葉，または下葉のグラフトを，気管支，肺動脈，肺静脈の順に吻合し，換気，再灌流を行った．再灌流後4時間まで経過観察し，生理学的なパラメータを記録，移植肺葉の局所CO2濃度を測定した．また移植肺の肺静脈血を直接穿刺により採取し，血液ガス分析を行った．以上により，ブタ肺葉移植モデルを確立するとともに，上葉移植と下葉移植の生理学的な違いを記録した． ② 選択的胃液注入によるブタ誤嚥性肺炎ドナーモデルの導入とin vivoでの局所CO2濃度測定：同様に体重45 kgのブタを用いた．全身麻酔酔下に気管支鏡を用いて選択的に左上葉，または下葉に胃液を注入し， 4時間の換気を行った．気管支鏡下に各肺葉気管支の局所O2濃度，CO2濃度，気道内圧を測定した．また超音波により各肺葉の肺水腫の程度を評価した．さらに左心房へ流入する肺静脈それぞれを直接穿刺することによりdifferential ABGを測定した．次いで，①と同様にドナー肺の灌流，摘出，肺葉移植を行い，再灌流後4時間まで経過観察し，各種パラメータを測定した． 小括：ブタ肺葉移植モデルは技術的に可能であり，手技的に確立された．局所CO2濃度に有意差を認めなかったものの，局所気道内圧と超音波での肺水腫の評価では有意差を認めた．

ドナー肺体外灌流システム（Ex Vivo Lung Perfusion：EVLP）は，トロント大学でドナー肺の“評価”だけではなく，長時間安定して灌流させることにより，虚血時間の延長による“保存”，さらには幹細胞，遺伝子，医療用ガス，薬剤などをドナー肺に導入する“治療”のプラットフォームとして発展し，現在，トロント方式のEVLPは世界の主流となっている．しかしながら，現状のトロント方式のEVLPもいくつかの解決困難な問題点を抱えている．本研究課題は，ものづくり日本のアイデアと技術を盛り込んだ日本発のEVLPシステムを開発し，日本では実施することが不可能であるヒト肺を用いた研究を，トロント大学において日加共同で行うことにより，広く世界で普及するシステムを送り出そうというものである．これまでの研究実績の概要は以下の通りである．1. 新規臓器灌流液EP-TU2の開発：株式会社細胞科学研究所（仙台市）との共同研究により，本邦の臨床肺移植で使用しているEP-TU液をベースに，日本発の新規臓器灌流液EP-TU2の開発に着手し，試作液を用いて大動物実験を行っている．2. 日本発の新規EVLPシステムの開発：ニプロ株式会社人工臓器開発センター（滋賀県草津市）との共同研究により，試作品を用いた大動物実験を行っている．12時間の安定した灌流を達成し，その後に実際に肺移植まで行い，良好な結果を得ている．3. トロント大学との共同研究：COVID-19パンデミックにより海外渡航は完全に閉ざされてしまっていたが，2022年度後半より，各種規制の緩和が進んできた．研究分担者が2022年度よりトロントへ留学し，共同研究の準備を進めている．引き続き定期的なウェブミーティングも行っている．4. スタンフォード大学との共同研究：臓器保存液への添加薬剤の共同研究を開始し，小動物モデルを用いて実験を進めている．．

IL-17を産生するTh17細胞を抑制するものとしてabataceptを用い慢性拒絶反応のマウスモデルである肺内気管移植モデルを用いて実験した。移植気管の閉塞、lymphoid neogenesisの状態を検討し、IL-17阻害剤がBOSに対する新たな治療薬となりえるか検討した。移植気管周囲のlymphoid neogenesisを計測したところ、control群に比較してIL-17阻害剤による治療を行なった群で有意に抑制された。したがって、BOSによる気管支周囲のリンパ新生lymphoid neogenesisを抑制し、IL-17阻害剤が新たなBOSの治療薬の候補となることが示された。

虚血再灌流性肺傷害は肺移植後の重大な合併症である。Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell (Muse細胞)の投与が虚血再灌流性肺傷害を改善するかどうかをラット左肺虚血・再灌流モデルを用いて検討した。Muse細胞、Mesenchymal stem cell (MSC)、PBSをそれぞれ2時間の虚血・再灌流直後に肺動脈から投与した。Muse細胞投与により再灌流後3日目および5日目にMSCを上回る動脈血酸素分圧、肺コンプライアンスならびに病理学的スコアの改善がみられ、Muse細胞が虚血再灌流性肺傷害の改善に寄与する事が明らかになった。

本研究では間葉系幹細胞の有する抗炎症効果、免疫調整効果に着目をして肺移植術後急性期死亡の主因である急性移植肺機能不全の予防効果をマウス肺移植モデルを用いて検討をした。移植6時間後に移植肺より回収した気管支肺胞洗浄液中のタンパク濃度はコントロール群に比して低値を示し炎症性サイトカインも低値を示す傾向であった。病理組織学的検討でも間葉系幹細胞投与群では肺障害は軽度であることが示唆された。間葉系幹細胞は再生医療以外にも抗炎症効果、免疫調整効果に着目をした臨床応用が行われ始めているが、肺移植においても応用が可能であることが示唆された。

本研究では、様々な液性因子分泌を介して抗炎症作用を発揮する間葉系幹細胞（mesenchymal stem cells: MSC）のレシピエントへの投与が、肺移植後急性拒絶反応を抑制するかどうかにつき主要組織適合性抗原不適合ラット肺移植モデルを用いて検討した。移植後6日目に移植肺を摘出し病理学的検討を行ったところ、MSC投与群において拒絶反応のステージとリンパ球浸潤、浮腫、肺胞内出血のスコアが、コントロール群と比較し有意に低値であった。定量RT-PCR解析では、移植肺内のTNF-αのmRNA発現は、hMSC投与両群でコントロール群と比較し低い傾向であった。