東北大学研究者紹介

研究分野 2

ライフサイエンス / 細胞生物学 /
ライフサイエンス / 機能生物化学 /

受賞 2

優秀演題賞（基礎領域）

2023年8月　日本亜鉛栄養治療研究会
Metallomics Poster Prize

2019年9月　International Society for Zinc Biology

論文 10

Zinc homeostasis governed by Golgi-resident ZnT family members regulates ERp44-mediated proteostasis at the ER-Golgi interface 国際誌査読有り

Yuta Amagai, Momo Yamada, Toshiyuki Kowada, Tomomi Watanabe, Yuyin Du, Rong Liu, Satoshi Naramoto, Satoshi Watanabe, Junko Kyozuka, Tiziana Anelli, Tiziana Tempio, Roberto Sitia, Shin Mizukami, Kenji Inaba

Nature Communications　14　(1)　2683-2683　2023年5月9日

DOI： 10.1038/s41467-023-38397-6 　

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Many secretory enzymes acquire essential zinc ions (Zn2+) in the Golgi complex. ERp44, a chaperone operating in the early secretory pathway, also binds Zn2+ to regulate its client binding and release for the control of protein traffic and homeostasis. Notably, three membrane transporter complexes, ZnT4, ZnT5/ZnT6 and ZnT7, import Zn2+ into the Golgi lumen in exchange with protons. To identify their specific roles, we here perform quantitative Zn2+ imaging using super-resolution microscopy and Zn2+-probes targeted in specific Golgi subregions. Systematic ZnT-knockdowns reveal that ZnT4, ZnT5/ZnT6 and ZnT7 regulate labile Zn2+ concentration at the distal, medial, and proximal Golgi, respectively, consistent with their localization. Time-course imaging of cells undergoing synchronized secretory protein traffic and functional assays demonstrates that ZnT-mediated Zn2+ fluxes tune the localization, trafficking, and client-retrieval activity of ERp44. Altogether, this study provides deep mechanistic insights into how ZnTs control Zn2+ homeostasis and ERp44-mediated proteostasis along the early secretory pathway.
Organelle-Level Labile Zn2+ Mapping Based on Targetable Fluorescent Sensors 査読有り

Rong Liu, Toshiyuki Kowada, Yuyin Du, Yuta Amagai, Toshitaka Matsui, Kenji Inaba, Shin Mizukami

ACS Sensors　7　(3)　748-757　2022年3月25日
出版者・発行元：American Chemical Society ({ACS})
DOI： 10.1021/acssensors.1c02153 　

ISSN：2379-3694

eISSN：2379-3694
A unique leucine-valine adhesive motif supports structure and function of protein disulfide isomerase P5 via dimerization 査読有り

Masaki Okumura, Shingo Kanemura, Motonori Matsusaki, Misaki Kinoshita, Tomohide Saio, Dai Ito, Chihiro Hirayama, Hiroyuki Kumeta, Mai Watabe, Yuta Amagai, Young-Ho Lee, Shuji Akiyama, Kenji Inaba

Structure　2021年4月
出版者・発行元：Elsevier {BV}
DOI： 10.1016/j.str.2021.03.016 　

ISSN：0969-2126
Quantitative Imaging of Labile Zn2+ in the Golgi Apparatus Using a Localizable Small-Molecule Fluorescent Probe 国際誌査読有り

Toshiyuki Kowada, Tomomi Watanabe, Yuta Amagai, Rong Liu, Momo Yamada, Hiroto Takahashi, Toshitaka Matsui, Kenji Inaba, Shin Mizukami

Cell Chemical Biology　27　(12)　1521-1531　2020年9月
出版者・発行元：Elsevier BV
DOI： 10.1016/j.chembiol.2020.09.003 　

ISSN：2451-9456

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Fluorescent Zn2+ probes used for the quantitative analysis of labile Zn2+ concentration ([Zn2+]) in target organelles are crucial for understanding the role of Zn2+ in biological processes. Although several fluorescent Zn2+ probes have been developed to date, there is still a lack of consensus concerning the [Zn2+] in intracellular organelles. In this study, we describe the development of ZnDA-1H, a small-molecule fluorescent probe for Zn2+, which exhibits less pH sensitivity, high Zn2+ selectivity, and large fluorescence enhancement upon binding to Zn2+. Through protein labeling technology, ZnDA-1H was precisely targeted in various intracellular organelles, such as the nucleus, mitochondria, endoplasmic reticulum, and Golgi apparatus. ZnDA-1H exhibited a reversible fluorescence response toward labile Zn2+ in these organelles in live cells. Using this probe, the [Zn2+] in the Golgi apparatus was estimated to be 25 ± 1 nM, suggesting that labile Zn2+ plays a physiological role in the secretory pathway.
Zinc regulates ERp44-dependent protein quality control in the early secretory pathway 査読有り

Satoshi Watanabe, Yuta Amagai, Sara Sannino, Tiziana Tempio, Tiziana Anelli, Manami Harayama, Shoji Masui, Ilaria Sorrentino, Momo Yamada, Roberto Sitia, Kenji Inaba

Nature Communications　10　(1)　2019年12月
出版者・発行元：Springer Science and Business Media LLC
DOI： 10.1038/s41467-019-08429-1 　

ISSN：2041-1723

eISSN：2041-1723
The Highly Dynamic Nature of ERdj5 Is Key to Efficient Elimination of Aberrant Protein Oligomers through ER-Associated Degradation 査読有り

Ken-ichi Maegawa, Satoshi Watanabe, Kentaro Noi, Masaki Okumura, Yuta Amagai, Michio Inoue, Ryo Ushioda, Kazuhiro Nagata, Teru Ogura, Kenji Inaba

Structure　25　(6)　846-857.e4　2017年6月
出版者・発行元：Elsevier BV
DOI： 10.1016/j.str.2017.04.001 　

ISSN：0969-2126

eISSN：1878-4186
Preparation of Selenoinsulin as a Long‐Lasting Insulin Analogue

Kenta Arai, Toshiki Takei, Masaki Okumura, Satoshi Watanabe, Yuta Amagai, Yuya Asahina, Luis Moroder, Hironobu Hojo, Kenji Inaba, Michio Iwaoka

Angewandte Chemie International Edition　56　(20)　5522-5526　2017年5月8日
出版者・発行元：Wiley
DOI： 10.1002/anie.201701654 　
Preparation of Selenoinsulin as a Long‐Lasting Insulin Analogue 査読有り

Kenta Arai, Toshiki Takei, Masaki Okumura, Satoshi Watanabe, Yuta Amagai, Yuya Asahina, Luis Moroder, Hironobu Hojo, Kenji Inaba, Michio Iwaoka

Angewandte Chemie　129　(20)　5614-5618　2017年5月8日
出版者・発行元：Wiley
DOI： 10.1002/ange.201701654 　

ISSN：1521-3773 1433-7851
Rabin8 suppresses autophagosome formation independently of its guanine nucleotide-exchange activity towards Rab8 査読有り

Amagai Yuta, Itoh Takashi, Fukuda Mitsunori, Kensaku Mizuno

The journal of biochemistry　158　(2)　139-153　2015年8月
出版者・発行元：Japanese Biochemical Society
DOI： 10.1093/jb/mvv032 　

ISSN：0021-924X

eISSN：1756-2651
NDR2-mediated Rabin8 phosphorylation is crucial for ciliogenesis by switching binding specificity from phosphatidylserine to Sec15 国際誌査読有り

Shuhei Chiba, Yuta Amagai, Yuta Homma, Mitsunori Fukuda, Kensaku Mizuno

The EMBO Journal　32　(6)　874-885　2013年2月22日
出版者・発行元：Wiley
DOI： 10.1038/emboj.2013.32 　

ISSN：0261-4189

eISSN：1460-2075

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Primary cilia are antenna-like sensory organelles protruding from the plasma membrane. Defects in ciliogenesis cause diverse genetic disorders. NDR2 was identified as the causal gene for a canine ciliopathy, early retinal degeneration, but its role in ciliogenesis remains unknown. Ciliary membranes are generated by transport and fusion of Golgi-derived vesicles to the pericentrosome, a process requiring Rab11-mediated recruitment of Rabin8, a GDP-GTP exchange factor (GEF) for Rab8, and subsequent Rab8 activation and Rabin8 binding to Sec15, a component of the exocyst that mediates vesicle tethering. This study shows that NDR2 phosphorylates Rabin8 at Ser-272 and defects in this phosphorylation impair preciliary membrane assembly and ciliogenesis, resulting in accumulation of Rabin8-/Rab11-containing vesicles at the pericentrosome. Rabin8 binds to and colocalizes with GTP-bound Rab11 and phosphatidylserine (PS) on pericentrosomal vesicles. The phospho-mimetic S272E mutation of Rabin8 decreases affinity for PS but increases affinity for Sec15. These results suggest that NDR2-mediated Rabin8 phosphorylation is crucial for ciliogenesis by triggering the switch in binding specificity of Rabin8 from PS to Sec15, thereby promoting local activation of Rab8 and ciliary membrane formation.

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MISC 2

初期分泌経路における新たなタンパク質品質管理機構 ---亜鉛イオンとERp44の協奏

天貝佑太, 渡部聡, 稲葉謙次

実験医学　38　(5)　775-782　2020年3月
細胞周期と高次な生命現象とのかかわり 8.一次繊毛形成と細胞周期のクロストーク

千葉秀平, 天貝佑太, 水野健作

実験医学　31　(2)　252-256　2013年2月1日
出版者・発行元：(株)羊土社
ISSN：0288-5514

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一次繊毛は、細胞膜表面に存在する突起構造で、細胞外からの機械的・化学的シグナルを受容するアンテナとして機能している。その形成異常や機能不全は嚢胞腎、網膜変性など多くの疾患と関連する。一般に、一次繊毛形成と細胞増殖は相反する関係にあり、細胞休止期に形成され、増殖相では消失する。また、一次繊毛が細胞周期の進行を調節し、増殖と分化を制御することも示唆されている。本稿では、一次繊毛形成を制御する分子機構について、特に、細胞周期の進行との関係に焦点を当てて、一次繊毛形成と細胞周期のクロストークに関する最近の知見を紹介する。(著者抄録)

共同研究・競争的資金等の研究課題 7

高時空間分解能解析によるゴルジ体亜鉛制御とエクトエンザイム活性化機構の解明

天貝佑太

2022年4月1日～ 2024年3月31日
分泌経路内の亜鉛が制御するタンパク質品質管理機構の解明

天貝佑太

2021年4月1日～ 2024年3月31日

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HeLa Kyoto細胞に、小胞体局在亜鉛輸送体ZIP7に対する阻害剤を処理したところ、阻害剤処理10分ごろから、小胞体中の遊離亜鉛濃度が劇的に上昇することが明らかとなった。さらに、分泌経路シャペロンタンパク質ERp44はその細胞内局在をゴルジ体から小胞体へと偏在させることが明らかとなった。これは、ERp44が小胞体から分泌できずに留まることが原因であった。ERp44基質タンパク質であるEro1aやERAP1を過剰発現させた細胞にZIP7阻害剤を処理したところ、これら基質タンパク質が細胞外へ分泌し、ERp44の基質の細胞内保持機能が阻害されることが示唆された。次に、ZIP7阻害時にどのような分泌タンパク質の細胞外分泌に異常が生じるかを解明するために、ZIP7阻害剤処理細胞またはZIP7発現抑制細胞を血清不含培地で培養後、培養上精に含まれるタンパク質を限外濾過によって濃縮し、SDS-PAGEとCBB 染色によって可視化した。その結果、ZIP7を阻害した両細胞で明らかにタンパク質量が増加するバンドが観察された。このタンパク質バンドをゲルから切り出し、質量分析によって同定することに成功した。さらに現在では、影響を受けるその他のタンパク質についても網羅的に同定するための実験系を確立し解析を進めているところである。 FLAGタグを付加したヒトZIP7-FLAGタンパク質を発現するプラスミドを構築し、ヒトZIP7-FLAGを安定発現するHEK293T細胞を樹立し、タンパク質の精製方法について条件検討を進めた。
細胞生物学とケミカルバイオロジーの融合による初期分泌経路の亜鉛イオン動態の解明

2020年4月～ 2022年3月
初期分泌経路への亜鉛流入機構と亜鉛酵素活性化機構の解明

天貝佑太

提供機関：Japan Society for the Promotion of Science

制度名：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)

研究種目：Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)

研究機関：Tohoku University

2020年4月～ 2022年3月

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昨年度までにゴルジ体に局在するZnTの発現抑制がゴルジ体内の遊離亜鉛濃度を低下させることを見出し、さらに、発現抑制するZnTによって濃度低下するゴルジ体の領域が異なることを発見した。ZnTは亜鉛イオンとプロトンのアンチポーターであるため、ZnTの発現抑制は、ゴルジ体内にプロトンを蓄積させ、pH が低下するのではないかと着想し、ZnTを発現抑制した細胞におけるゴルジ体pHを、pHプローブであるpHluorin2を用いて解析した。その結果、ZnTの発現抑制はゴルジ体のpHに影響を与えないことが明らかとなった。このことは、ゴルジ体におけるpHの調節が亜鉛調節の上流に位置する可能性を示唆した。ビオチンの添加によって小胞体からの出芽を誘導できるRUSHシステムを用いて、ERp44を小胞体からゴルジ体へ同調輸送する実験系を開発した。このシステムでERp44の動きを観察したところ、ビオチン添加後小胞体からゴルジ体に移行し、その後小胞体へと戻る様子が観察された。これは、ERp44がゴルジ体で亜鉛イオンと結合することで、C末端RDEL配列を介したゴルジ体から小胞体への逆行輸送が生じていると考えられrた。ゴルジ体に局在するZnT亜鉛輸送体を発現抑制した細胞では、ERp44のゴルジ体局在の時間に変化が見られたことから、ゴルジ体における亜鉛イオンの濃度調節がERp44の亜鉛化に重要な役割を果たしていることがサポートされた。 ERp44以外の亜鉛酵素についても同様の解析を行い、酵素活性を測定する実験系を開発した。小胞体からゴルジ体へ移行し分泌小胞へと輸送される過程で酵素の活性化が生じる経過を見出しつつある。
ZIP亜鉛輸送体による初期分泌経路の亜鉛制御とその機能解明

2021年11月～
亜鉛輸送体とERp44による初期分泌経路タンパク質品質管理機構の解明

天貝佑太

提供機関：Japan Society for the Promotion of Science

制度名：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Early-Career Scientists

研究種目：Grant-in-Aid for Early-Career Scientists

研究機関：Tohoku University

2019年4月1日～ 2021年3月31日
分泌経路におけるERp44を介したタンパク質品質管理機構とその生理的意義の解明

天貝佑太

提供機関：Japan Society for the Promotion of Science

制度名：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Young Scientists (B)

研究種目：Grant-in-Aid for Young Scientists (B)

研究機関：Tohoku University

2017年4月1日～ 2019年3月31日

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ERp44は小胞体局在タンパク質や、高次構造が未成熟なタンパク質を基質タンパク質としてゴルジ体で捕え、小胞体へ逆行輸送する事で、初期分泌経路のタンパク質品質管理に関わる。しかしながら、ERp44の高次生理機能には不明な点が多い。本研究では、ERp44結合タンパク質をBioID2を用いて網羅的に同定し、ERp44が細胞外基質と結合することが示唆された。また、一連の発現抑制実験から、ERp44を制御する因子として亜鉛トランスポーターを同定することに成功した。

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